在重力效應(yīng)研究中，人源胃類(lèi)器官在模擬微重力環(huán)境下的培養(yǎng)需結(jié)合三維培養(yǎng)技術(shù)、微重力模擬設(shè)備特性及類(lèi)器官培養(yǎng)規(guī)范，從設(shè)備選擇、培養(yǎng)體系優(yōu)化、實(shí)驗(yàn)操作規(guī)范、生物學(xué)分析四個(gè)方面進(jìn)行系統(tǒng)設(shè)計(jì)，以揭示重力變化對(duì)胃類(lèi)器官發(fā)育、功能及疾病模型構(gòu)建的影響。
一、設(shè)備選擇與參數(shù)校準(zhǔn)
1.回轉(zhuǎn)儀類(lèi)型：選擇旋轉(zhuǎn)壁生物反應(yīng)器（RWV）或隨機(jī)定位儀（RPM）模擬微重力環(huán)境。RWV通過(guò)水平旋轉(zhuǎn)實(shí)現(xiàn)離心力與重力平衡，適用于長(zhǎng)期培養(yǎng)（數(shù)周至數(shù)月）；RPM通過(guò)雙軸隨機(jī)旋轉(zhuǎn)快速改變重力矢量方向，適用于短期實(shí)驗(yàn)（如細(xì)胞信號(hào)通路研究）。
2.關(guān)鍵參數(shù)：轉(zhuǎn)速需低速設(shè)置（如1-4rpm）以避免剪切力干擾，同時(shí)需實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)重力數(shù)值（精度±0.001G）確保環(huán)境穩(wěn)定。
3.培養(yǎng)容器：使用透氣性硅膠膜或中空纖維結(jié)構(gòu)的培養(yǎng)瓶，支持氣體交換并減少流體剪切力（<0.1 dyne/cm2），保護(hù)敏感細(xì)胞。
二、培養(yǎng)體系優(yōu)化
1.基質(zhì)膠與細(xì)胞懸液混合：
使用Matrigel或合成聚乙二醇基質(zhì)，在4℃下過(guò)夜解凍，并按7:3體積比與細(xì)胞懸液混合，避免產(chǎn)生氣泡。
2.初始接種密度調(diào)整至5,000-10,000個(gè)細(xì)胞/μL，避免過(guò)高導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)不足，過(guò)低抑制3D聚集體形成。
培養(yǎng)基配方與動(dòng)態(tài)灌注：
基礎(chǔ)培養(yǎng)基：DMEM/F12補(bǔ)充10% FBS、1× L-glutamine、1× N2、1× B27、50 ng/mL EGF、100 ng/mL Noggin、50 ng/mL R-spondin 1等生長(zhǎng)因子。
動(dòng)態(tài)灌注系統(tǒng)：結(jié)合微流控芯片實(shí)現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)/氧氣動(dòng)態(tài)供應(yīng)，避免微重力下液體分層導(dǎo)致的代謝廢物積累。例如，每2-3天更換培養(yǎng)基，并補(bǔ)充抗氧化劑（如NAC）以應(yīng)對(duì)氧化應(yīng)激。
三、實(shí)驗(yàn)操作規(guī)范
1.樣本采集與處理：
樣本來(lái)源：手術(shù)組織（首選）、腹水/胸腔積液或穿刺活檢組織，需經(jīng)病理鑒定且腫瘤細(xì)胞含量≥10%。
無(wú)菌操作：組織離體后10分鐘內(nèi)浸入保存液，全程密封運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室，避免污染。
組織消化：使用膠原酶IV（1 mg/mL）和脫氧核糖核酸酶（0.2 mg/mL）在37℃下解離1-2小時(shí)，每隔20分鐘機(jī)械吹打促進(jìn)解離。
2.接種與固化：
種板技術(shù)：將20 μL混合液接種于預(yù)熱的48孔板中心，避免接觸側(cè)壁，倒置培養(yǎng)箱中孵育10-20分鐘使Matrigel固化。
培養(yǎng)基添加：固化后緩慢滴加250 μL預(yù)熱培養(yǎng)基，確?；|(zhì)膠被完全覆蓋，減少邊緣效應(yīng)。
四、生物學(xué)分析
1.形態(tài)學(xué)與功能驗(yàn)證：
顯微鏡觀察：使用相差顯微鏡或共聚焦顯微鏡評(píng)估類(lèi)器官形態(tài)（致密型、囊泡型、混合型）和完整性，活率需≥50%。
免疫組化與基因檢測(cè)：通過(guò)HE染色驗(yàn)證核深染、異常分裂象等腫瘤特征，短串聯(lián)重復(fù)序列（STR）檢測(cè)確認(rèn)類(lèi)器官與原腫瘤組織遺傳一致性。
2.微重力效應(yīng)評(píng)估：
細(xì)胞骨架分析：定量分析微管重組和F-actin分布變化，揭示微重力對(duì)細(xì)胞力學(xué)特性的影響。
信號(hào)通路調(diào)控：通過(guò)RNA-seq檢測(cè)差異基因（如整合素、HIF-1α通路），蛋白組學(xué)驗(yàn)證關(guān)鍵通路（如NF-κB、MAPK）活性變化。
