卵巢類器官的培養(yǎng)方法涉及多個步驟，這些步驟需要精確操作和嚴(yán)格的無菌條件。以下是一個詳細(xì)的卵巢類器官（以卵巢癌類器官為例）培養(yǎng)方法：

一、取材與預(yù)處理

取材：采用無菌器械，保證無菌環(huán)境，將新鮮的人卵巢癌活檢組織樣本迅速放入裝有適量預(yù)冷收樣培養(yǎng)基（如原代組織保存液）的離心管或錐形管中，并放置在冰上以保持低溫，迅速進(jìn)行后續(xù)處理。

清洗：在生物安全柜中，將組織轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中，用適量的PBS溶液（添加雙抗以防污染）多次沖洗，直至液體變得清澈。此步驟旨在去除組織表面的血液、雜質(zhì)和潛在污染物。

二、組織處理與細(xì)胞解離

去除脂肪與壞死組織：用無菌手術(shù)刀剔除脂肪及壞死組織，只選取活的腫瘤組織（通常為粉紅色）。

組織切割：將腫瘤組織切割成1~2mm3的小塊。此步驟可以留存適量組織用于測序、免疫組化分析和后續(xù)的類器官構(gòu)建等實(shí)驗(yàn)。

細(xì)胞解離：收集所有剩余的組織碎片，加入適量的解離培養(yǎng)基（如特定的酶解液），并在37℃條件下解離1~2小時(shí)。每隔一段時(shí)間（如20分鐘），用移液器進(jìn)行機(jī)械吹打，以促進(jìn)解離過程。解離完成后，通過細(xì)胞篩網(wǎng)（如70μm）過濾懸浮液，以收集解離的細(xì)胞。

三、細(xì)胞懸液制備與計(jì)數(shù)

終止消化：向懸浮液中加入適量的預(yù)冷培養(yǎng)基（如DMEM/F12含10%FBS）以終止消化反應(yīng)。

離心與重懸：將懸浮液在4℃條件下以一定離心力（如220g）離心5分鐘。離心后，用適量的培養(yǎng)基（如DMEM/F12）沖洗細(xì)胞一次，并再次離心收集細(xì)胞沉淀。然后，用適量的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，將細(xì)胞懸液調(diào)整至適當(dāng)?shù)臐舛龋ㄈ?000個細(xì)胞/μL）。

四、類器官培養(yǎng)

基質(zhì)膠混合：將凍存的Matrigel在4℃下過夜解凍。然后，在冰上以適當(dāng)?shù)捏w積比（如7:3）將Matrigel與細(xì)胞懸液混合，并輕輕吹打以避免產(chǎn)生氣泡。

接種：從37℃培養(yǎng)箱中取出預(yù)熱的培養(yǎng)板（如48孔板），將適量的混合液（如20μL）接種到每個孔中（約含30000個細(xì)胞）。注意要接種在孔的中心位置，并確保沒有氣泡和側(cè)壁接觸。

固化與培養(yǎng)：將培養(yǎng)板倒置放入37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育一段時(shí)間（如20分鐘），以使Matrigel固化并確保細(xì)胞的均勻分布。然后，向每個孔中緩慢滴加適量的預(yù)熱的類器官培養(yǎng)基，確保基質(zhì)膠被完全覆蓋。將培養(yǎng)板置于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。每2~3天更換一次培養(yǎng)基，但請注意，用于換液的類器官培養(yǎng)基中不應(yīng)含有某些可能影響類器官生長的成分（如Y27632）。

五、類器官鑒定與傳代

鑒定：使用顯微鏡觀察類器官的形態(tài)結(jié)構(gòu)和大小，以此評估其三維球體形成能力和完整性。同時(shí)，可以通過與原組織的HE染色和免疫組化進(jìn)行對比，或檢測特定標(biāo)志物（如P53/PAX-8/CK7）的表達(dá)情況來進(jìn)行鑒定。條件允許的情況下，還可以進(jìn)行全外顯子測序（WES）以獲取更全面的信息。

傳代：當(dāng)類器官生長到一定階段時(shí)，需要進(jìn)行傳代以維持其生長和活性。傳代步驟包括吸出類器官培養(yǎng)液、機(jī)械分離Matrigel、加入適量的胰蛋白酶進(jìn)行消化、終止消化、離心收集細(xì)胞沉淀、用PBS清洗后再次離心、將所得細(xì)胞沉淀按照適當(dāng)?shù)谋壤ㄈ?:3至1:5）進(jìn)行傳代等。

六、類器官凍存與復(fù)蘇

凍存：取適量的類器官，經(jīng)過消化、離心后收集細(xì)胞沉淀。加入適量的細(xì)胞凍存液，重懸細(xì)胞后轉(zhuǎn)入凍存管中。利用程序降溫盒將細(xì)胞緩慢降溫至-80℃。第二天，將凍存的卵巢癌類器官轉(zhuǎn)移到液氮中進(jìn)行長期儲存。

復(fù)蘇：將液氮中凍存的卵巢癌類器官置于37℃水浴鍋中進(jìn)行解凍，注意控制水浴時(shí)間不超過2分鐘。將解凍后的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入離心管中，加入適量的預(yù)冷培養(yǎng)基。在4℃條件下以一定離心力離心后取細(xì)胞沉淀。將所得細(xì)胞沉淀按照傳代步驟進(jìn)行處理，完成卵巢癌類器官的復(fù)蘇。

注意事項(xiàng)

所有操作需在無菌環(huán)境下進(jìn)行，以避免污染。

使用的試劑和材料應(yīng)確保無菌且質(zhì)量可靠。

在操作過程中應(yīng)注意避免產(chǎn)生氣泡和機(jī)械損傷類器官。

定期觀察類器官的生長情況和形態(tài)變化，以及時(shí)調(diào)整培養(yǎng)條件和處理方法。

通過以上步驟，可以成功培養(yǎng)出卵巢癌類器官，并用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究和應(yīng)用。同時(shí)，這些方法也可以為其他類型的卵巢類器官培養(yǎng)提供一定的參考和借鑒。