腸道類器官培養(yǎng)是一種模擬體內(nèi)腸道環(huán)境，在體外培養(yǎng)腸道干細(xì)胞和多能干細(xì)胞以形成具有腸道結(jié)構(gòu)和功能的類器官的技術(shù)。以下是腸道類器官培養(yǎng)的基本方法：

一、材料準(zhǔn)備

1.組織來源：通常來源于人類小腸和結(jié)腸的生物組織，這些組織可以是健康的，也可以是腫瘤組織，但必須確保合規(guī)性。

2.試劑與培養(yǎng)基：

70%（V/V）乙醇：用于消毒和清潔。

AdvDMEM+++（或其他適用的培養(yǎng)基）：用于細(xì)胞培養(yǎng)。

Primocin（原代細(xì)胞抗生素）：用于防止細(xì)菌感染。

膠原酶2、Y-27632 RhoⅡ型激酶抑制劑等：用于組織消化和細(xì)胞分離。

BME（基質(zhì)膠/基底膜）：為類器官提供支撐和營養(yǎng)。

紅細(xì)胞裂解液：用于去除紅細(xì)胞。

擴(kuò)增培養(yǎng)基（含Wnt-3a、Rspo-1、Noggin、EGF等生長因子）：用于促進(jìn)類器官的生長和分化。

3.耗材：

離心管（15ml和50ml）、培養(yǎng)皿（10cm）、手術(shù)刀、封口膜、搖床、細(xì)胞過濾器（100μm）、移液管（5ml）、24孔板等。

二、培養(yǎng)步驟

4.1.組織處理：

將組織保存在含有AdvDMEM+++和Primocin的50ml離心管中，4℃保存直至使用。

在生物安全柜中，將工作區(qū)除菌，并處理相關(guān)器材。

將組織轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中，并用手術(shù)刀切成1立方毫米左右的小塊狀。

2.組織消化：

添加消化培養(yǎng)基（含膠原酶等）并用移液管吹打混勻。

將組織轉(zhuǎn)移到離心管中，用培養(yǎng)基沖洗培養(yǎng)皿以確保組織全部進(jìn)入離心管。

蓋上離心管蓋子，用封口膜封住，置于搖床上進(jìn)行消化。

3.細(xì)胞分離與重懸：

采用細(xì)胞過濾器過濾細(xì)胞，并用注射器推桿幫助細(xì)胞通過濾網(wǎng)。

離心后棄去上清液，用AdvDMEM+++沖洗細(xì)胞并再次離心。

最后一次將細(xì)胞用BME重懸。

4.類器官形成：

將適量細(xì)胞BME混合液添加在預(yù)熱的24孔板中。

將24孔板倒置在37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中，使液滴凝固。

小心地在每孔添加擴(kuò)增培養(yǎng)基和RhoKi。

持續(xù)觀察類器官生長狀態(tài)。

5.傳代培養(yǎng)：

去除類器官培養(yǎng)基，用預(yù)冷AdvDMEM+++沖洗類器官并破壞BME液滴。

收集類器官并轉(zhuǎn)移到新的離心管中進(jìn)行離心。

用BME重懸類器官并重新接種在預(yù)熱的培養(yǎng)基中。

置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，并定期更換培養(yǎng)基。

三、注意事項

1.無菌操作：整個培養(yǎng)過程必須在無菌條件下進(jìn)行，以防止細(xì)菌和其他微生物的污染。

2.溫度控制：細(xì)胞培養(yǎng)箱的溫度應(yīng)保持在37℃，以模擬體內(nèi)環(huán)境。

3.CO2濃度：細(xì)胞培養(yǎng)箱中的CO2濃度應(yīng)保持在5%，以維持細(xì)胞的正常生長和分化。

4.定期觀察：應(yīng)定期觀察類器官的生長狀態(tài)，及時發(fā)現(xiàn)并處理污染或異常情況。

5.質(zhì)量控制：對類器官進(jìn)行質(zhì)量控制，包括生長活力評估、細(xì)胞懸液數(shù)量評估、單細(xì)胞懸液活力評估以及免疫學(xué)標(biāo)記物的表達(dá)評估等。

通過以上步驟，可以在體外成功培養(yǎng)出具有腸道結(jié)構(gòu)和功能的類器官，為腸道疾病的研究和治療提供有力的工具。